【產(chǎn)品名稱(chēng)】 雙鏈 DNA 超敏檢測(cè)試劑盒（熒光法） 英文名稱(chēng)：Qubit® dsDNA HS Assay Kits
【包裝規(guī)格】 100 人份&500 人份/盒
【用途】
常規(guī)的DNA含量的檢測(cè)方法是在260nm（A260）處測(cè)其吸光值。這種方法的主要缺點(diǎn)是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對(duì)信號(hào)的影響很大，并且還會(huì)受到核酸制備過(guò)程中污染物的干擾，無(wú)法區(qū)分DNA和RNA，而且這種方法不靈敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。PicoGreen定量檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、方便，被多家生物制品廠所選擇，成為生物制品殘留DNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。目前該方法已納入2010年版《中國(guó)藥典》
例如：Nanodrop系列微量分光光度計(jì)是目前最常見(jiàn)的紫外吸光法檢測(cè)測(cè)樣品的濃度及純度， 由于它會(huì)檢測(cè)吸光度在260nm處所有物質(zhì)的吸光值（如DNA/RNA以及降解核酸和游離核苷酸等其他雜質(zhì)），因此讀數(shù)并不是十分準(zhǔn)確。而熒光計(jì)通過(guò)熒光染料與特定目標(biāo)分子結(jié)合后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)目標(biāo)分子的濃度，因此其定量結(jié)果一般低于A260nm處的讀數(shù)，但是更為準(zhǔn)確。
重要的是準(zhǔn)確的DNA定量對(duì)于后續(xù)應(yīng)用至關(guān)重要。 Nanodrop系列全波長(zhǎng)微量分光光度計(jì)無(wú)法精確測(cè)定 5ng/ul 以下的 DNA 濃度，然而，許多 DNA 樣品又恰在這個(gè)范圍之內(nèi)，在檢測(cè)雙鏈 DNA 時(shí)，熒光計(jì)的檢測(cè)極限可達(dá) 0.5pg/ul。此時(shí)，更靈敏的熒光計(jì)似乎是個(gè)更好的選擇。 熒光計(jì)和相應(yīng)的定量試劑盒，能快速靈敏、精確測(cè)定 DNA 的濃度。
本試劑將被用于成本昂貴的下游實(shí)驗(yàn):qPCR 、PCR 克隆、轉(zhuǎn)染和新一代測(cè)序等精密測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，精準(zhǔn)定量范圍10pg /μL至10ng/μL。
【檢驗(yàn)原理】
PicoGreen與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出的熒光，無(wú)DNA不發(fā)熒光；所發(fā)熒光與DNA濃度成正比。在2010年《中國(guó)藥典》中提出，PicoGreen定量DNA的方法檢出限約10pg/uL，DNA含量在10pg/uL~10ng/uL 范圍時(shí)線性較好(R2>0.99). 本試劑盒利用 Picogreen DNA 染料能夠特異性結(jié)合雙鏈 DNA，而不與蛋白質(zhì)、RNA、鹽離子結(jié) 合的原理，通過(guò)激發(fā)光照射，Qubit 檢測(cè)儀收集發(fā)射光，特異的分析樣品中雙鏈 DNA 的實(shí)際含量，能夠 排除樣品中蛋白質(zhì)、RNA、鹽離子等物質(zhì)的干擾，從而對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行精準(zhǔn)的定量。
優(yōu)點(diǎn)：
該方法可以測(cè)定來(lái)源于任何表達(dá)宿主樣品中的雙鏈DNA。
可以直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而無(wú)需從反應(yīng)混合物中純化DNA。
遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)紫外A260的檢測(cè)方法和Hoechst33258的靈敏度。
特異性檢測(cè)與Mg2+、氯化鈉、醋酸鈉、醋酸銨、乙醇、苯酚、氯仿、SDS、RNA、蛋白質(zhì)、Triton-X100、 dNTPS、BSA等干擾物沒(méi)有交叉反應(yīng)。
在等摩爾濃度 ssDNA 和 RNA 存在的條件下測(cè)定 dsDNA，其影響很小。
【所需器材】Qubit® assay tubes (500 tubes, Life Technologies, Cat. no. Q32856)或者 Axygen® PCR-05-C tubes(VWR, part no. 10011-830)； 熒光儀（Qubit 2.0 ，Qubit 3.0 等熒光儀）
【注意事項(xiàng)】
1. 檢測(cè)溫度：所有檢測(cè)必須在室溫操作(22–28?C)；
2. 孵育時(shí)間：DNA 與工作液混合后，反應(yīng) 3min，熒光信號(hào)在 3 個(gè)小時(shí)內(nèi)都是穩(wěn)定的。
3. 熒光校準(zhǔn)：每次使用前，請(qǐng)按照批次使用校準(zhǔn)，以確保實(shí)時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)的一致性。
【試劑盒組份】
|
Components |
100assays |
500 assays |
Concentration |
Storage |
|
Qubit dsDNA HS Reagent (Component A) |
50μL |
0.25mL |
200X in DMSO |
4oC Protect from light 12months |
|
dsDNA HS Buffer (Component B) |
10mL |
50mL |
TE Buffer |
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dsDNA HS Standard#1 (Using Component B) |
N/A |
N/A |
0 ng/uL in TE Buffer |
|
|
dsDNA HS Standard#2(Component C) |
0.2mL |
1mL |
10 ng/uL in TE Buffer |
*備注：不同批次的試劑不可混合使用：
【檢驗(yàn)方法】
1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1）在使用前，將試劑盒中的各組分恢復(fù)至室溫。
2）準(zhǔn)備足夠量 0.5 mL PCR 薄壁管并標(biāo)注。請(qǐng)勿在 PCR 管側(cè)壁標(biāo)注，以免影響熒光信號(hào)采集。推薦使用 Qubit® assay tubes（Cat. No. Q32856）或 Axygen® PCR-05-C tubes（Cat. No. 10011-830）。
2. 配制檢測(cè)工作液
在塑料容器中，使用 dsDNA Buffer 按比例將適量dsDNA Reagent 稀釋至1×（例：取1 μL dsDNA Reagent，加入 199 μL dsDNA Buffer），現(xiàn)用現(xiàn)配。工作液配制好后，3小時(shí)內(nèi)使用。
3. 配制待檢樣品
1）配制待檢標(biāo)準(zhǔn)品。取 190 μL 檢測(cè)工作液至標(biāo)準(zhǔn)品 PCR 管中，分別加入 10 μL dsDNA Standard 1 和 dsDNA Standard 2 至相 應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品 PCR 管中，輕輕渦旋振蕩 2-3 sec，盡量避免氣泡產(chǎn)生。
2）配制待檢樣品。取 180-199 μL 檢測(cè)工作液至樣本 PCR 管中，分別加入 1-20 μL 待檢樣本，使 PCR 管中每個(gè)樣本終體積 為 200 μL，輕輕渦旋振蕩 2-3 sec，盡量避免氣泡產(chǎn)生。
4. 檢測(cè)
1）將所有待檢 PCR 管置于室溫避光孵育 2 min。
2）按照 Qubit®熒光儀的操作說(shuō)明，選擇 dsDNA High Sensitivity 檢測(cè)程序測(cè)定熒光信號(hào)值。
【操作流程圖例】
2. Qubit® 3.0 操作步驟
2.1 在 Qubit® 3.0 主屏幕操作頁(yè)面，選擇 DNA，然后選擇檢測(cè)類(lèi)型 dsDNA High Sensitivity。顯示“Read standards”，選擇 Read Standards 進(jìn)行檢測(cè)。
2.2 將裝有 Standard #1 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #1。
2.3 將 裝有 Standard #2 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #2。
2.4 按鍵 Run samples。
2.5 在讀取頁(yè)面，選擇相應(yīng)的單位和體積；
2.5.1 從旋轉(zhuǎn)輪面板上選擇+或-按鈕來(lái)選擇添加到試管中的樣品體積（從1 - 20μl）；
2.5.2 從下拉菜單中選擇測(cè)量樣品濃度的濃度單位。
2.6 將裝有待測(cè)樣品的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read ，讀取完成后(~3 seconds), 移走樣品， 直至樣品測(cè)完。
3. Qubit® 2.0 操作步驟
3.1 在 Qubit® 2.0 主屏幕操作頁(yè)面，選擇 DNA，然后選擇檢測(cè)類(lèi)型 dsDNA High Sensitivity。顯示“Read standards”，
選擇 Read Standards 進(jìn)行檢測(cè)。
3.2 將裝有 Standard #1 的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋，按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #1。
3.3 將 裝有 Standard #2 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #2。
3.4 按鍵 Run samples。
3.5 將裝有待測(cè)樣品的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read，讀取完成后(~3 seconds),移走樣品，直至樣品測(cè)完。
3.6 按照200/X公式計(jì)算管中DNA濃度。
樣品濃度 = QF value ×（ QF Value :Qubit® 2.0 直接測(cè)量得到樣品的結(jié)果；X:加入的樣品的體積）
污染物對(duì) dsDNA 定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響
Effect of contaminants in the Qubit ® dsDNA HS Assay, tested over a range of 1–500 ng/mL
|
污染物 Contaminant |
10 μL 樣品中的濃度 Concentration in10 μL Sample |
樣品檢測(cè)時(shí)濃度 Final Concentration in the assay |
檢測(cè)結(jié)果 Result |
|
Salts |
|||
|
Ammonium acetate |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Sodium acetate |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Sodium chloride |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Magnesium chloride |
40 mM |
2 mM |
OK |
|
Organic Solvents |
|||
|
Phenol |
2% |
0.1% |
OK |
|
Ethanol |
20% |
1% |
OK |
|
Chloroform |
4% |
0.2% |
OK |
|
Detergents |
|||
|
Sodium dodecyl sulfate |
0.2% |
0.01% |
OK |
|
Triton X-100 |
0.02% |
0.001% |
OK |
|
Other Compounds |
|||
|
Bovine serum albumin |
400 μg/mL |
20 μg/mL |
OK |
|
RNA |
1×* |
1×* |
OK |
|
dNTPs |
2 mM |
100 μM |
OK |
|
Polyethylene glycol |
20% |
1% |
OK |
|
Agarose |
2% |
0.1% |
OK |
*1×：表示含有與 dsDNA 相同濃度的 RNA。
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