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產(chǎn)品特點(diǎn)：采用精準(zhǔn)的探針法熒光定量檢測，確保準(zhǔn)確性；

布氏桿菌熒光 PCR 檢測試劑盒

使用說明書

用途

本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測牛、羊、豬、馬等牲畜的乳腺、淋巴結(jié)等組織病料和陰道分泌物、精液等液體病料中的布氏桿菌（BS）。適用于布氏桿菌感染的輔助診斷。試劑盒為預(yù)混體系，此體系包含熒光 PCR 檢測所需的核酸擴(kuò)增酶、反應(yīng) buffer 及特異性引物和探針，加入提取的樣品 DNA 并補(bǔ)足 20 μL 體積的水后即可直接進(jìn)行熒光 PCR 檢測。

原理

在Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

儲(chǔ)存條件及有效期

核酸提取試劑室溫保存（蛋白酶K需要放置-20℃保存），擴(kuò)增反應(yīng)試劑置于-20℃保存。試劑盒有效期為12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

目錄號(hào)：JC1001

包裝規(guī)格：48次/盒

試劑盒組成

操作步驟

1、樣品前處理

1.1組織樣品：每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1 g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取上清液200 μL于1.5 mL滅菌離心管中；

1.2將拭子用無菌生理鹽水沾濕，收集陰道分泌物、流產(chǎn)物、陰莖分泌物、眼鼻分泌物樣品。再將拭子插入無菌生理鹽水（多余部分掰斷，蓋好蓋子），渦旋震蕩混勻，取上清200 μL于1.5 mL滅菌離心管中；

1.3精液、尿液、乳汁、關(guān)節(jié)炎和水囊瘤液直接取200 μL于1.5 mL滅菌離心管中。

2、 DNA提取

2.1上述1.5mL離心管中加入200 μL結(jié)合液CB，立刻劇烈顛倒輕搖充分混勻，再加入20 μL蛋白酶K (20 mg/mL)溶液（第一次使用蛋白酶K加入1mL滅菌水），充分混勻，70℃放置10 min。

2.2冷卻后加入100 μL異丙醇，劇烈顛倒輕搖充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

2.3將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm離心30 s，倒掉收集管中的廢液（上述各步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15s混勻）。

2.4加入500 μL抑制物去除劑IR，12,000 rpm 離心30 s，棄廢液。

2.5加入700 μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30 s，棄掉廢液。

2.6加入500 μL漂洗液WB，12,000 rpm 離心30 s，棄掉廢液。

2.7將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

2.8取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱），室溫放置3-5 min，12,000 rpm 離心1 min。

2.9 DNA可以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間存放，可以放置在-20℃。

3、 檢測步驟

3.1試劑的準(zhǔn)備

從試劑盒中取出擴(kuò)增反應(yīng)試劑，冰上融化并振蕩混勻后，10,000 rpm離心10 s。

設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照），每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：

計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000 rpm離心10 s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15 μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品/陰性對(duì)照/陽性對(duì)照5 μL，10,000rpm瞬時(shí)離心10秒。

3.1 qPCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置

4、 結(jié)果說明

4.1結(jié)果分析條件設(shè)定

讀取檢測結(jié)果?閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整?

4.2試驗(yàn)有效判定

陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線?陰性對(duì)照無Ct值并且無特定擴(kuò)增曲線。

4.3結(jié)果描述及判定

4.3.1 陰性判定

無 Ct 值并且無特定擴(kuò)增曲線?

4.3.2 陽性判定

Ct 值≤35，且出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，樣本判定陽性?

4.3.3 可疑判定

對(duì)于Ct 值＞35的樣本，如沒有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則判為陰性；如有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線則判為可疑，可疑樣本建議重提核酸后再次擴(kuò)增。重做結(jié)果如仍是可疑，則判為樣本陽性；否則判為陰性。